生物病理切片
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病理組織石蠟切片制作流程及常見問題分析

2020-08-01 10:44:09

病理組織石蠟切片染色是臨床診斷的重要輔助手段[1].石蠟切片不易脫片,染色后可被長期保存,使得石蠟切片同患者病歷一樣,可被長期封存,對預防醫療事故的發生有一定作用,故被各大醫院廣泛應用.常規病理切片的制作步驟中有許多注意事項.本文主要從組織固定取材、脫水包埋、切片、漂片等過程,介紹病理石蠟切片制作過程中易出現的問題和解決辦法,以期進一步改善常規病理切片的制作,提高病理切片質量.


病理切片

 1、組織固定取材注意事項

臨床所取標本要新鮮,否則細胞內溶酶體會破裂,造成細胞自溶.組織固定液多選用10%中性福爾馬林,其有效成分為甲醛,甲醛易揮發,使得福爾馬林的效用會越來越低,所以福爾馬林現配現用;固定液體積要超過標本的10~20倍,否則固定不充分,影響染色;固定標本的容器要以使標本不變形為宜[2];取材時,除嚴格按照病理標本取材操作規范外,小標本一般全取,大標本在去除不必要的組織后,要特別注意病變部位與正常組織交界處[3];取材切片觀察面要平整,否則組織經脫水后變韌,導致組織包埋時不能壓平于包埋盒中,切片時修整蠟塊很繁瑣.

2、脫水包埋注意事項

現組織多采用程序化脫水浸蠟,所以要根據標本的多少及大小及時更換脫水機內試劑,否則會影響脫水效果,使組織與蠟不能相溶,無法制作出合格的組織蠟塊.條件允許的情況下可根據組織標本的不同選擇合適的石蠟,組織韌性大選擇高熔點石蠟,組織軟選取低熔點石蠟.包埋時,組織要充分壓平于包埋模底部,以保證組織的預期觀察切面在同一水平;先向包埋盒中灌滴少許液體石蠟,此步驟可使成型蠟塊底部光滑平整,再將組織觀察面壓平于包埋盒底部,組織擺放緊湊但不重疊.為使包埋組織的蠟塊快速凝固,一般先將浸液體蠟的包埋盒置于冷凍臺上,蠟塊在置于冷凍臺上后,應在蠟大部分或完全凝固后(圖1A),再移動包埋盒;若蠟塊未完全凝固(圖1B),而移動了包埋盒,成型蠟塊底部平整度相差甚遠,有的凝固蠟塊底部平整(圖2A),有的蠟塊底部不平整(圖2B),可致小標本在修片的過程中被浪費.

3、切片注意事項

切片時常見問題及常用解決方法如下:(1)切片橫向褶皺過多,不能成帶(圖3).原因:蠟塊溫度過高;切片刀變鈍;切片刀邊緣粘有少量石蠟.解決方法:將蠟塊重新放置冰袋或冷凍盒上,使蠟塊降溫;更換切片刀的位置,或換新的切片刀;或用水沾濕紗布,順切片刀刀口方向,輕輕擦拭切片刀.(2)切片上有位置固定的一道或幾道裂縫或裂紋(圖4).原因:切片刀有小缺口;蠟塊內有雜質或體積較小的似骨(鈣)化性較硬的組織;包埋時蠟塊不均勻凝固.解決方法:移動切片刀或更換新的切片刀;用少量鹽酸軟化硬的鈣化性組織;重新包埋蠟塊.(3)切片上有位置不定的數道小裂縫或裂紋(圖5).原因:蠟塊溫度過高;切片刀變鈍.解決方法:將蠟塊重新放置冰袋或冷凍盒上,使蠟塊降溫;更換切片刀的位置,或更換新的切片刀.(4)切出的蠟條明顯向一側彎曲變形(圖6).原因:彎曲處蠟塊質地不均,蠟塊未修整好,邊緣毛糙[4]等;彎曲處切片刀變鈍.解決方法:重新修整蠟塊;移動切片刀;冷凍蠟塊,蠟塊質地稍變硬后也可以使彎曲變小.(5)切片厚薄不均,或是每固定幾片后,切出一張完整的片子.原因:蠟塊過硬或過大;蠟塊夾持器或切片刀松動;切片機微動失靈,不能調節出正確的切片厚度.解決方法:組織塊過硬可重新取材包埋,過大可重新包埋;調整機器,上緊刀片;修理機器.

4、漂片注意事項

漂片溫度選擇比蠟塊熔點低10℃即可.溫度過高會使蠟條產生數目不等的小氣泡.

5、烤片注意事項

烤片時溫度與時間的選擇范圍廣,可從37℃烤箱烤干1天至75℃烤箱烤干20min,可以根據不同目的需要,確定烤片時間和溫度,或是依石蠟熔點來確定,一般將溫度控制比石蠟熔點高10~15℃.

6、染色注意事項

 (1)組織脫蠟透明等過程采用物質分子相似相溶原理,試劑有效成分容易減少,所以脫蠟試劑要及時更換[5],若脫蠟不充分,會使切片染色不均勻;因乙醇、二甲苯等易揮發,故在操作完成時,應及時封蓋,溶液濃度降低會影響洗片效果;(2)染色時,鹽酸乙醇分化步驟尤其重要,分化的目的是使胞核染色,而無背景色.明礬蘇木精性質使其在酸性溶液中呈現紅色,在堿性溶液中呈現藍色.在鹽酸乙醇分化時,切片由深藍變為粉紅色時,應停止分化.分化時,有經驗者可以肉眼觀察切片至粉紅色時終止分化,初學者可鏡下多次觀察切片,至切片除胞核外,無其他背景著色時,停止分化;或是依據鹽酸乙醇濃度,確定分化時間,試劑初配制時,鹽酸乙醇濃度高,分化時間短,反之則分化時間延長.切片分化完成后,將切片移至弱堿性的溶液中返藍,一般采用自來水,或是溫度在50℃的自來水中,因其本身為弱堿性,且取用方便,所以被廣泛使用.

7、封片注意事項

(1)需吹干或烤干切片上水分,否則鏡下觀察時有一層白霧,導致細胞輪廓不清楚;(2)病理組織切片HE染色一般采用中性樹膠封片,封片時以無氣泡為準,否則會影響鏡下觀察;常用24mm×32mm大小的蓋玻片,只需用一次性的巴氏吸管滴2滴中性樹膠即可,過少則致封片不完全,過多則致中性樹膠外溢.


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